荧光显微镜是监测细胞生理状态的重要工具。荧光显微镜最关键的特性是能够在黑暗背景下照亮荧光物体，这些物体可能非常微弱，若无此技术则难以检测。为了优化荧光，必须尽可能最大化图像的亮度和分辨率。为了区分目标荧光和视野中的其他物体，使用滤光片组合来观察特定的激发光达到样品中的荧光团。

对荧光显微镜的理解,重要的是要了解荧光本身的基础过程。荧光涉及荧光指示剂吸收光能(即光子)的过程,随后在仅仅几纳秒内发射部分光能(作为另一个光子)。在这个过程中,会损失一部分能量,所以发射的光子拥有比吸收光子更低的能量。荧光指示剂发射的光通常会具有比激发光更长的波长。荧光显微镜原理上是通过将发射光与激发光分离开来,从而将样本中的暗部和亮部分离出来。

图1.显微镜的基本组成部分和荧光成像的光路。不同于单一的光路，有两个或多个滤光镜与激发光和发射光波长相关,位于目标镜前后。图像由BioRender制作。

影响荧光显微镜的三个常见因素:亮度、分辨率和维护

亮度

图像的总亮度将影响荧光是否容易被检测和拍摄。样品必须提供足够的光能量来激发每个附着在样品上的染色体所需要的波长。适当滤光器的选择将有助于最大限度地将发射的荧光导向观察或相机管,同时阻止不需要的波长。因此,汞灯或氙灯是理想的灯源,因为它们能量高,将提供大量 Needed荧光激发能量来适当照亮样品。

此外，物镜有助于从样本中收集光线，并直接影响观察到的图像的亮度强度。建议使用具有高质量色差校正的物镜，以帮助产生更清晰的图像。物镜还应设计成在接近紫外线波长的光照射下不会自发荧光。油浸物镜可以用来帮助减少由于光线在玻璃载玻片和/或盖玻片表面反射而导致的光损失。尽管荧光显微镜制造商试图制造完全不含自发荧光组件的显微镜，但这仍然应该被考虑在内。

分辨率

合适的盖玻片也有助于提高图像分辨率。盖玻片的厚度不等，通常在0.01至0.03毫米之间，显微镜物镜应该进行微调以适应这些变化。有时，购买精度非常高的盖玻片是确保物镜校正始终以最佳状态进行的最佳途径。

物镜应该定期使用适当的溶剂进行清洁，大约每个月一次。任何多余的油都有可能吸附灰尘，这将降低生成图像的质量和分辨率。在为油浸物镜选择油时，确保油不含PCB，几乎不自发荧光，且在物镜与盖玻片接口使用时不会形成气泡。

维护

操作显微镜的人应该秉持以下原则:

1.保持所有光学元件完全无尘,清洁,防止油脂,溶剂或任何其他可能的污染物。

2.显微镜应存放在烟雾尽量少、环境尽可能清洁、振动少或为零、通风系统空气流动平稳的房间内。

3.当不使用时应给显微镜盖上罩子,所有附属组件尽可能保存在防尘密闭容器内存储。

注意：标准各不相同，但通常最佳做法是尽量减少接触。最重要的是细致对待,以最大程度地避免损坏,校准问题及其他可避免的问题。

4.不应使用腐蚀性溶剂清洁仪器的任何部分，稀释的肥皂水通常是最好的清洁剂。在清洁物镜前，应先使用压缩气体除去松散的灰尘和颗粒。内部镜片上的污垢应由专业人员清除，因此联系制造商将了解下一步的操作。对于外部镜片和其他容易接触的组件，温和而持续的清洁和维护可以延长荧光显微镜的使用寿命。

5.清洁镜头时一定要非常轻柔,因为即使是镜头纸也可能在镜面的表面产生极细的划痕。镜头清洁布是常见的选择。有许多专门用于光学表面清洗的溶剂,但必要时也可以用乙醇替代。蒸馏水也常被选用。值得注意的是,其他溶剂可能会与镜片上产生化学反应的涂层。例如,氨常被证明会破坏防反射涂层。丙酮也可能对塑料部件产生损害,所以清洗时需要小心。

注意:清洁镜片时,首先用清洁剂或乙醇浸湿棉签,轻轻擦拭镜片表面几遍,每擦一次都要转动棉签,以防粉尘再次沾染上表面。

图2.清洗外部显微镜镜片去除污迹的有效方法。最好的做法是由中心向外进行轻轻圆周型律动,而不是随机或不稳定的移动,否则可能会漏洗部分区域或者造成损坏。图示由BioRender制作。

荧光显微镜故障处理技巧

应尽可能防止光漂白，因为这会对样本造成损害。可以通过向样本添加抗褪色试剂、使用特殊介质，减少样本暴露于光下的时间来实现。减少这种曝光包括减少总体光强度或在不观察或拍摄样本时，使用显微镜照明器中的滤光片滑块或快门阻挡激发光的方法。

如果在制片前彻底清洗染色后的样本以去除过多的荧光物质，也可以限制样本的自发荧光。

虽然透明胶片可能因其能提供增强的对比度和色彩饱和度而更受青睐，但日光平衡透明胶片可能有助于提供样本颜色、分辨率或对比度的最佳呈现。

建议和预防措施

 表一.不断增加的媒体注意事项

1.理想情况下所有显微镜观察都应在黑暗房间内进行,对荧光显微镜来说这一点尤其重要。因为人眼很难快速适应黑暗,而荧光信号比较弱时,眼睛就很难在黑暗中辨别细微的荧光变化。

2当选择适合显微镜的组件时,建议选择一款配有玻璃或石英透镜的目标物镜。这种镜头材料在近紫外光区域具高透明度。

3.使用最低放大倍数的投影镜将有助于限制图像的总放大倍数。

4.对比反射式荧光光学成像,总体来说采用透射式荧光时成像效果较差。不过,如果采用透射式,使用暗场造片机可以有助于改善成像质量。

注意:选择合适的光圈滤膜也有助于优化样品中荧光素的对比度。关键是这些滤膜需要匹配样品的荧光激发和二级荧光特性。

最佳的光源选择是氙气灯和汞蒸气灯，或者可以精确调节到特定波长的激光灯。

对任何类型的荧光显微镜来说,在照明源和荧光滤镜之间加入一个隔热滤镜都非常重要。这能有效限制可能造成的过热损害。

当灯具开始闪烁,或者样品的部分区域明暗不均时,很可能就是时候更换光源了。

图3.U2OS细胞经过1小时的Calcein AM孵育后固定于含2%甲醛的96孔黑色板内。去除全部培养基后加入防褪色染料。使用荧光显微镜与相同的曝光设置对0秒和30秒的FITC信号强度进行比较。