对于细胞培养的同学们来说，最不想遇到的就一定是污染，那各种各样的细胞污染当中，例如细菌污染、真菌污染、病毒污染、支原体污染等等，其中支原体污染是这些污染重最难以分辨、去除的污染之一，接下来我们将全方位来对支原体污染的知识点进行总结归纳。

Part1 支原体是啥？

支原体最早在1898年被发现，是没有一类没有细胞壁、高度多形性、可以穿过0.22μm滤芯的最小原核细胞微生物。支原体大小一般在0.1-0.3μm之间，体型介于细菌和病毒之间，可以在无生命的培养基中自行生长繁殖，不需寄生，一般附着在皿瓶表面，对绝大多数抗生素有耐药性。

根据研究数据表明，细胞培养过程中细胞支原体污染的发生率超过了60%，而且，在细胞陪支原体污染之后，期初是没有办法发现细胞明显的形态变化，不会出现明显的培养基浑浊变色，也不会出现明显的细胞死亡，等发现异常的时候，细胞已经经过多次传代，甚至分不清是在哪一代保种是出现的污染，导致无法根治，只能从头再来，所以，支原体污染是目前科研细胞培养中的一大难题。

Part2 细胞咋被污染的？

实验室中出现的支原体类型绝大多数都是以下四类：

口腔支原体、精氨酸支原体、猪鼻支原体、莱氏无胆甾支原体。

实验室中出现的支原体污染途径主要有以下几种：

1、细胞间交叉支原体污染；

2、科研人员的口腔皮肤，在科研过程中没有按要求做好无菌防护，通过口腔呼出的气液体或皮肤上沾染实验操作台导致口腔支原体、发酵支原体和人型支原体的污染；

3、工作环境及实验器材污染，支原体在超净台或生物安全柜上存活的时间最多可以持续5天，这就意味着在五天内有污染过的细胞在环境中进行过操作，就可能会导致其余细胞也出现污染；

4、细胞培养试剂污染，精氨酸支原体以及无胆甾支原体主要来源就是胎牛血清以及新生牛血清，如果是猪源的胰酶，也可能存在猪鼻支原体；

5、灭菌不恰当，没有彻底灭菌，没有均匀灭菌，存在卫生死角等等也会导致支原体污染加剧。

Part3 如何判断支原体污染

在细胞培养中，我们第一步是需要在以下几种情况下去重点观察细胞是否存在支原体污染：

1、细胞生长变慢(原先生长时间2天长满的细胞，花了4天还没有长满);

2、细胞状态变差(原先细胞状态饱满圆润立体，逐渐变瘦变扁);

3、细胞边界模糊(细胞相互粘连，边界不清晰无法分辨);

4、细胞形态异常(细胞形态出现拉丝铺展等情况);

5、在上述情况出现的同时，培养基上清液澄澈、换液后细胞状态依旧无改变。

但是要确定存在支原体污染，还是需要通过以下几种方法：

1、微生物培养法：取怀疑存在支原体污染的细胞上清样，在特殊琼脂培养基中培养，在37℃环境中孵育14天，阳性情况会出现“煎蛋状”菌落。

2、DNA荧光染色法:支原体中的DNA中主要以A-T为主，可以被Hoechst 33258染色，存在支原体污染的细胞染色后会明显看到细胞周围有许多大小相近的荧光小点或丝状物，即表明存在支原体污染。

3、PCR法：通过扩增支原体16S核糖体RNA基因，可以检测多种支原体，操作相较更快速、准确性也相对较高。