论文题目：Unique features of the m6A methylome in Arabidopsis thaliana
刊登日期：2014年11月
发表杂志：Nature Communications
影响因子：12.124
研究机构：芝加哥大学何川/Joy Bergelson课题组、北京大学贾桂芳课题组
芝加哥大学化学系何川教授、生态系Bergelson教授与北京大学化学生物系贾桂芳教授于2014年首次采用MeRIP-seq（m6A-seq）的方法揭示了拟南芥RNA甲基化修饰的独特特性。
早在2012年，美国康奈尔大学医学院的Jaffrey教授和以色列特拉维夫大学的Rechavi教授两个独立课题组分别采用了m6A抗体RIP的方法进行高通量测序，揭示了哺乳动物的RNA甲基化修饰特征。随后酵母等物种也相继发布了RNA甲基化相关研究。在植物中，m6A甲基转移酶缺陷可导致胚胎致死性表型，表明了m6A对植物发育也起着至关重要的作用。
在这篇文章中，作者绘制出了两种拟南芥中的m6A全转录组图谱，揭示了m6A在植物mRNA中独特且高度保守的修饰形式。不同于哺乳动物中的m6A修饰，拟南芥中m6A不仅在终止密码子和3' UTR内富集，在起始密码子的周围也存在大量的m6A修饰。GO功能富集分析表明m6A在拟南芥的独特分布和与叶绿体相关的一些植物特异性信号通路有关联。此外，作者还发现了m6A修饰水平和mRNA转录水平之间存在正相关关系，表明m6A对植物基因的表达起重要的调控作用。
已知拟南芥mRNA上存在丰度较高的m6A修饰。作者选取了来自瑞典、法国、荷兰、西班牙、意大利等十种不同地理型拟南芥（见上表），这些拟南芥在维度以及光合有效辐射上（PAR）有显著区别。
通过分析m6A甲基化比例发现，十种地理型拟南芥甲基化比例范围从0.45–0.65%不等。尽管作者推测m6A甲基化水平较为稳定且和PAR并无直接关系，但是诸多其他环境因素还是会对拟南芥m6A水平产生影响。
接下来作者选取了Can-0和Hen-16两个地理型作为材料，采用m6A-seq测序的方法进行深入研究。Can-0在春季的PAR有123.74，而Hen-16在春季的PAR只有55.29，所以通过LC-MS/MS分析可以看出Can-0整体的m6A水平要高于Hen-16。
作者从Can-0中的6289个基因里鉴定到了7489个Peak，从Hen-16中的5416个基因里鉴定到了6094个Peak。其中有4317个Peak在两个样本中都有检测到，这表明m6A修饰在拟南芥中高度保守。
作者对11个m6A修饰差异的基因以及6个对照基因进行了RT-qPCR验证，结果基本符合预期。
在此基础上，作者估算每1000个碱基有0.5-0.7个m6A Peak。这个结果不仅与先前哺乳动物的m6A-seq中的结果相似，也和LC-MS/MS分析结果相似（即甲基化率在0.45-0.65%左右）。
为了在Peak中寻找m6A甲基化修饰相关的motif RRACH，作者挑选了1000个显著Peak进行motif分析。结果表明，有934个Peak中至少存在一种motif。而这种motif不仅在植物中保守，而且也与哺乳动物和酵母的motif相同。
作者对m6A-RIP测序样本（IP）和对照样本（input）中的reads在转录本上的分布特性做了分析后发现，IP样本在起始密码子、终止密码子以及3’ UTR上富集程度较高。在先前哺乳动物和酵母的分析结果中，起始密码子附近并没有reads富集情况。
作者对所有的基因peak分布区域分析后发现，reads在终止密码子附近富集程度最高（61%），接下来分别是起始密码子（16%）、编码区（13%）和3’ UTR（9%）。从基因整体结构上，终止密码子上依旧是富集程度最高，这种情况与人类中的情况相似。通常m6A Peak主要位于起始密码子的60bp下游位置和50bp上游位置，终止密码子下游80bp位置和100bp上游位置，以及ployA前80-220bp位置处。在本次测序结果中，拟南芥的富集区域主要集中在转录本3’终止密码子区以及ployA尾100-150bp处。
此外，作者还在终止密码子附近鉴定了属于拟南芥特有的motif（如上图所示），这些与哺乳动物完全不同的motif揭示了植物独特的甲基化修饰机制。
作者还鉴定了1684个具有差异甲基化修饰的基因保守度与人相似，同时其中813个基因（48%）也在人中有表达。所有人和拟南芥共有基因甲基化富集最高的区域分别是终止密码子（74%）以及3’ UTR（14%），而起始密码子（6%）则属于拟南芥独有的。作者将小鼠和人的m6A富集区域做了整体统计发现，拟南芥在起始密码子区域m6A富集属于独有现象。
已知m6A对植物发育至关重要，作者对m6A修饰较高的基因进行了GO功能富集分析后发现，大部分基因都集中在叶绿体/质体（chloroplast/plastid）以及蛋白转运定位等功能上。下一步，作者对Peak在不同区域分成了四个大类后，再对每个子类别进行GO功能富集分析。
毫无疑问，四个子类别中绝大部分Peak所在基因都富集在了叶绿体/质体上。接下来，作者对富集到叶绿体/质体的基因Peak子类别中的比例做了统计，其中PeakBoth比例最高，超过了60%。下一步，作者将关心重点放在了光合作用上。STN8基因，也叫At5g01920以及另两个基因At5g08670和At3g44610都参与光合作用，与光和体系II中大量蛋白的磷酸化相关。在本次测序结果中，这三个基因都在起始密码子和终止密码子存在Peak。
作者从Can-0以及Hen-16中各鉴定出1319和546个特异Peak，此外一些共有基因Peak差异也较大。如At5g06290基因在Can-0中的起始密码子附近Peak较高但在Hen-16却没有任何Peak。
作者接下来使用转录组测序进行验证，在甲基化的基础上分析基因的转录水平。在Can-0和Hen-16中分别鉴定出801个和1011个高表达的基因。这些基因反应了拟南芥不同的地理型在PAR差异巨大的情况下转录水平也发生了对应的变化。
在Can-0高表达的基因list中，作者发现其m6A Peak峰也比Hen-16要高。同样在Hen-16高表达的基因list中，m6A Peak峰也显著高于Can-0。这个现象表明每种地理型拟南芥有其自身特色的m6A甲基化修饰位点，并与基因激活（gene activation）相关。这个假设似乎与哺乳动物的研究相反，即m6A会介导mRNA的降解。但是仔细观察后我们可以发现，m6A修饰程度高且表达量上升的mRNA，其m6A Peak基本都富集在5’端以及起始密码子区。
为了证实5’端的m6A修饰程度高与基因转录水平正相关这个假设，作者对前面四种不同的子类别Peak与基因的表达量做了相关性分析。结果表明，PeakStart以及PeakBoth与基因转录水平呈现正相关性。进一步分析四种Peak内基因的表达量后发现，PeakStart平均表达量最高（盒形图）。
因此作者得出结论，5’高甲基化水平不仅能够维持基因的高转录水平，还能维持mRNA的稳定性。作者猜测可能有一些阅读蛋白在识别m6A后能够防止mRNA被降解。
那么低甲基化水平究竟和基因的低转录水平相关吗？为了证实这个猜想，作者将本次低甲基化的基因与先前已发表的低甲基化拟南芥测序结果做比较后发现，本次测序结果与已发表的结果基本吻合。
作者最后猜测植物mRNA上miRNA结合位点可能与m6A修饰有关，通过生物信息学分析发现关联性不强。
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